En sus continuas idas y venidas por sus reinos Carlos delegó la regencia a diferentes personas de su influencia: el cardenal Adriano (futuro papa Adriano VI), más tarde reforzado con dos nobles españoles, por la su mujer, la emperatriz y por su hijo Felipe (futuro Felipe II) y en Aragón por virreyes.

El emperador empieza su declive. En el año 1554 renuncia, a favor de su hijo Felipe (futuro Felipe II) los territorios de Nápoles y Milán. En 1555 Borgoña y los Países Bajos. En 1556 cede los territorios de España.

El 3 de febrero de 1557 Carlos I entra en el Monasterio de Yuste (Cáceres). Tiene para sí, en su casa, cincuenta y un ayudantes. Su residencia ha sido ayudada a construir por fray Antonio de Villavastín y allí entabló amistad con otro arquitecto, Juan de Herrera, ambos construirán, junto a otros, el Monasterio de San Lorenzo de El Escorial (Madrid)

Tras unas semanas con dolores insufribles por su gota y el paludismo recientemente añadido a sus males, Carlos I muere el 21 de septiembre de 1558 en el Monasterio de Yuste (Cáceres).

Sus restos descansan en el Monasterio de El Escorial (Madrid).